天正6年(1578年)祖父惟教與父親惟直、叔父鎮(zhèn)忠于耳川之戰(zhàn)敗死后繼承第十七代家督，之后抵抗北上的島津軍不斷努力。天正十四年（1586年）十月，島津家久統(tǒng)率一萬兵馬揮軍北上，從日向往豐后攻打，同時島津義久也派出許多使者招降大友家臣，在周遭許多同僚響應(yīng)臣服時，佐伯惟定卻堅持不肯投降。

期間，佐伯惟定請伊東舊臣山田匡得協(xié)助，擴充整備宇山城、 八幡山砦等各處支城積極防戰(zhàn)，在島津家久派遣僧人玄西堂來勸降時將二十名使者全數(shù)殺害，以示堅決的抗戰(zhàn)意圖。

        在明白招降無望后，島津家久對栂牟禮城發(fā)動攻勢，命土持親信及新名親秀率兩千兵馬火燒岸河內(nèi)，之后進擊堅田，惟定在聽聞斥侯傳來的軍情后，將城中兵力一分為三，經(jīng)塩月、江頭、西野分別趕赴堅田迎戰(zhàn)，在猛將山田匡得的奮戰(zhàn)下，佐伯惟定終將島津軍擊退，逐出岸河內(nèi)。

        十二月，佐伯惟定出兵攻打柴田紹安、左京進父子所在的星河城，在城落之后佐伯惟定補殺了柴田紹安之子左京進、次郎及其一族，令柴田紹安大為驚恐而再度投降大友家，被佐伯惟定利用為先鋒攻打天面山城。在擊退了來襲的島津軍之后，佐伯惟定與甫突破新納忠元包圍的岡城城主志賀親次展開熾烈的反擊，呼應(yīng)豐臣秀長，順勢恢復(fù)大友家的領(lǐng)地，將當(dāng)初被島津家寢返的南郡諸城逐步奪回大友家，支持到豐臣秀吉本陣出動。

        天正十五年（1587年）正月，豐臣秀吉正式開始進行九州討伐，佐伯惟定于同年三月攻克土持親信所在的朝日岳城，并在島津義弘、 家久兩軍合流回歸日向時發(fā)動急襲，將島津軍擊潰，在戰(zhàn)場上大為活躍的佐伯惟定因而得到秀吉所賜的感狀。

        在豐臣秀吉出兵朝鮮時，佐伯惟定做為大友軍的一員從軍參陣，不料主公大友義統(tǒng)因風(fēng)聞敵方大軍來襲的消息后自前線逃跑，引起秀吉大怒，領(lǐng)地被沒收。失去領(lǐng)地的佐伯惟定后來因受到羽柴秀保賞識將他推薦給筆頭家老藤堂高虎擔(dān)任家臣，方能維持生計。文祿四年(1595年)，藤堂高虎入國伊予宇和島得到七萬石的封地時佐伯惟定也從高虎處拜領(lǐng)了兩千石的俸祿，與藤堂良勝交替擔(dān)任國府城城代。

        慶長五年（1600年）關(guān)原會戰(zhàn)時，主君藤堂高虎因為素與德川家康修好而投入東軍，是役之中佐伯惟定并未參戰(zhàn)而是被任命伊予板島城留守居役的職務(wù)，戰(zhàn)后藤堂高虎被轉(zhuǎn)封至伊勢津城，此后十年間身為藤堂藩士之一的佐伯惟定主要負責(zé)領(lǐng)內(nèi)的各城的普請職務(wù)。

        關(guān)原之戰(zhàn)后，德川家康開創(chuàng)江戶幕府，身任征夷大將軍，隨后又把將軍之位讓于世子秀忠，稱大御所。但是居于大阪城中的豐臣秀賴，終究是德川政權(quán)的不安定因素，于是家康費盡苦心方硬借方廣寺鐘銘的事件挑起大阪之戰(zhàn)。在冬之陣中佐伯惟定在高虎麾下率領(lǐng)士隊十騎、卒隊四十人出陣，與藤堂高刑合作擔(dān)任右先鋒。戰(zhàn)后因功增加五百石，總共領(lǐng)有四千五百石的知行領(lǐng)位列藤堂藩的重臣之一。

        元和四年(1618年)，佐伯惟定逝世，享年五十歲，法名宗忠功月大禪定門。家祿由其子惟重繼承，此后佐伯家世代擔(dān)任藤堂家臣直到明治時代。