高知藩士。早年文武兼修，研習(xí)國學(xué)，修煉劍術(shù)，曾游學(xué)江戶，師從鹿持雅澄、麻田勘七、若山勿堂。在江戶時(shí)代歷任郡奉行、大目付，參與藩政。后來與坂本龍馬有深交，積極推動(dòng)“大政奉還”運(yùn)動(dòng)，戊辰戰(zhàn)爭期間率領(lǐng)海援隊(duì)占領(lǐng)幕府的長崎奉行所。維新后進(jìn)入新政府，歷任參與、參議、司法大輔等職。明治4年（1871年）參加巖倉遣外使節(jié)團(tuán)考察歐美各國司法制度。征韓論爭后留在政府，西南戰(zhàn)爭爆發(fā)后抑制高知的士族反亂。明治11年（1878年）在大久保利通死后，與元田永孚等人推動(dòng)天皇親政運(yùn)動(dòng)。明治14年任參議兼工部卿。深得明治天皇的信任，在宮中擁有很大的勢力。歷任宮中顧問官、樞密顧問官，并擔(dān)負(fù)皇太子明宮（大正天皇）的御養(yǎng)育工作。

文政13年10月12日（1830年11月26日）生于土佐國吾川郡瀨戶村（高知縣高知市），土佐藩士佐佐木高順（100石）的次子。出生前的5月19日父親即去世，家祿被遞減到48石，姐姐千代子的丈夫谷潤三郎作為養(yǎng)子以佐佐木高下之名入繼佐佐木家繼承家督，高行的幼年時(shí)代在貧窮的生活中度過。

元治元年（1864年）因養(yǎng)兄去世，佐佐木高行繼任家督。他向劍道家麻田直養(yǎng)（勘七）學(xué)習(xí)劍術(shù)，向山鹿流兵學(xué)洼田清音的門生若山勿堂學(xué)習(xí)兵法，向鹿持雅澄學(xué)習(xí)國學(xué)，還和同在鹿持門下的武市瑞山（半平太）等交流，響應(yīng)尊王攘夷運(yùn)動(dòng)，是藩內(nèi)尊攘派的上層武士，盡管與勤王黨有明顯的區(qū)別，但仍為幕末的政局努力奔走。后作為藩主山內(nèi)豐信（容堂）的親信而領(lǐng)藩政，歷任文武調(diào)役、作事奉行、郡奉行、普請奉行、大目付（大監(jiān)察）。慶應(yīng)2年（1866年）奉藩命赴筑前國福岡藩太宰府觀察時(shí)局動(dòng)態(tài)，收集情報(bào)。慶應(yīng)3年（1867年）作為大目付出使長崎，與坂本龍馬合作為國事而周旋。同年上洛，和后藤象二郎、坂本龍馬等商議薩摩和土佐結(jié)盟（薩土盟約）以及建議大政奉還等事務(wù)。他與后藤象二郎說服藩主勸告幕府奉還大政。

慶應(yīng)4年（明治元年、1868年）戊辰戰(zhàn)爭爆發(fā)，幕府軍敗北。同年1月，江戶幕府的長崎奉行河津祐邦出走，佐佐木高行率領(lǐng)海援隊(duì)相關(guān)案件接管長崎奉行所，在長崎裁判所總督澤宣嘉和參謀井上馨的推薦下，被任命為參謀助理，主持處于真空地帶的長崎的事務(wù)。明治元年（1868年）2月29日任長崎裁判所判事兼九州鎮(zhèn)撫使參謀，審判了鎮(zhèn)壓天主教信徒的事件（浦上四番崩）和土佐藩士殺傷法國水兵事件（堺事件）等相關(guān)案件。廢藩置縣后，明治元年5月25日任富岡縣知事、天草縣知事，同年8月29日任鎮(zhèn)將府判事。明治元年（1868年）12月12日——明治2年（1869年）5月15日任明治政府刑法官判事，受命調(diào)查橫井小楠暗殺事件、參與東京奠都·明治天皇迎入事務(wù)、對戊辰戰(zhàn)爭戰(zhàn)敗的槺疚溲锏日椒傅畝ㄗ锪啃獺Ｃ髦?年（1869年）5月15日——明治2年（1869年）7月8日任刑法官副知事。

明治2年（1869年）7月8日——明治3年（1870年）2月5日任刑部省刑部大輔（相當(dāng)于刑部侍郎），明治3年（1870年）2月5日——明治4年（1871年）6月25日任太政官參議（相當(dāng)于參知政事），明治3年（1870年）10月7日兼任刑部省御用掛，同年12月20日，他與鶴田皓、津田真道、水本成美、邨岡良弼協(xié)力完成刑法的新律綱領(lǐng)的制定。明治4年（1871年）6月29日任制度取調(diào)御用專務(wù)。明治4年（1871年）7月9日——明治6年（1873年）4月17日任司法省（刑部省改為司法�。┧痉ù筝o，明治6年（1873年）11月13日——明治7年（1874年）1月15日任司法大判事（大法官）。明治6年11月作為巖倉使節(jié)團(tuán)的成員（理事官），與平賀義質(zhì)、岡內(nèi)重俊等赴歐美各國考察司法制度。

旅途過程中，在訪問美國前搭乘“美利堅(jiān)”號蒸汽船時(shí)，佐佐木高行看到團(tuán)員們的野蠻粗俗的動(dòng)作緊皺眉頭，抵達(dá)美國后，大使巖倉具視放棄和服而改穿洋裝，他認(rèn)為這是輕率和欠考慮的。對于“外國通”的副使伊藤博文所表現(xiàn)出來的欣喜若狂的姿態(tài)，佐佐木在日記中表示了憤慨。另一方面，出于社交活動(dòng)的需要，他也身穿西服出入社交界，感覺很不習(xí)慣，在日記中以“不恰好”、“窮屈”的詞匯來表述，意思是“不倫不類”、“不舒暢”。佐佐木高行批判了表面上的“文明開化”，主張保持日本固有的制度和精神，同時(shí)也強(qiáng)調(diào)重視西方文明的吸收借鑒。他認(rèn)為應(yīng)放緩改革的速度，循序漸進(jìn)，盡量將改革的沖擊所造成的混亂限制在最小的范圍。繼訪美之后，接連訪問英國、法國、德國、意大利，在各國的法院參觀考察。明治6年（1873年）在使節(jié)團(tuán)之前橫渡印度洋返回日本，3月11日抵達(dá)橫濱港。歸國后，在給政府的報(bào)告中提出應(yīng)戒除激進(jìn)的改革，采取穩(wěn)健的步驟，主張漸進(jìn)論。但是他的這種推進(jìn)改革的思維受到留守政府的批判。

明治六年政變，佐佐木高行的同鄉(xiāng)后藤象二郎、板垣退助辭職下野，他則留在了政府。明治7年（1874年）7月5日——明治8年（1875年）4月14日任太政官左院副議長。1875年（明治8年）大阪會(huì)議廢止左院，設(shè)立元老院。明治8年（1875年）7月2日——明治13年（1880年）3月13日任元老院議官。明治9年（1874年）9月18日任訴訟法取調(diào)委員。明治11年（1878年）3月5日任宮內(nèi)省一等侍補(bǔ)，明治11年（1878年）12月24日兼任海軍省御用掛，明治12年（1879年）10月23日兼任宮內(nèi)省御用掛。明治13年（1880年）3月13日 —— 明治14年（1881年）10月21日任元老院副議長。明治13年（1880年）6月5日任海上裁判所訴訟規(guī)則審查總裁，同年12月28日任日本海令草案審查總裁。明治14年（1881年）10月21日——明治18年（1885年）12月22日任參議兼工部卿（相當(dāng)于工部尚書同平章事）。明治16年（1883年）3月16日代理海軍卿。

明治9年（1876年）10月和明治10年（1877年）6月兩次返回土佐，為了防止不平士族和板垣退助以及民權(quán)派的煽動(dòng)，他和中島信行受政府之命致力于對士族進(jìn)行游說安撫。同年10月隨著西南戰(zhàn)爭的結(jié)束，待土佐的局勢恢復(fù)平靜，佐佐木高行回到東京。明治11年（1878年）致力于地方議會(huì)的整備。根據(jù)擔(dān)當(dāng)明治天皇教育工作的元田永孚與右大臣巖倉具視的協(xié)議，同年3月5日，佐佐木高行任宮內(nèi)省一等侍補(bǔ)。佐佐木高行作為天皇的側(cè)近，極力促進(jìn)天皇的心理成長和政治意欲的提高，大張旗鼓地向“天皇親政運(yùn)動(dòng)”轉(zhuǎn)移。所謂天皇親政，又稱天皇親裁，就是天皇親自裁決國家大政，近侍內(nèi)臣助言輔弼。說白了就是將過去太閣、將軍所掌握的權(quán)力歸于天皇，內(nèi)廷近侍取代幕閣大老、老中的角色，究其實(shí)質(zhì)就是排斥受憲法和議會(huì)約束的君主立憲制，實(shí)行中國式的封建君主專制，即絕對君主制。

明治10年（1877年）8月，宮內(nèi)省設(shè)置侍補(bǔ)，職能是對天皇的輔佐和指導(dǎo)。翌年3月追加佐佐木高行為侍補(bǔ)。明治政府首班的內(nèi)務(wù)卿大久保利通對“天皇親政”有一定的了解，他在薩摩藩的親信吉井友實(shí)被選為一等侍補(bǔ)，使大久保與侍補(bǔ)建立了協(xié)調(diào)關(guān)系。大久保與兼任侍補(bǔ)的宮內(nèi)卿商討輔導(dǎo)天皇的事宜，期望明治天皇成為擔(dān)負(fù)近代國家之主體的君主，期待侍補(bǔ)務(wù)必為培養(yǎng)君德而盡力。大久保建議將天皇的意圖滲透進(jìn)政府的構(gòu)想。但明治11年（1878年）5月14日大久保被暗殺使計(jì)劃受挫，侍補(bǔ)的構(gòu)想與政府的應(yīng)對發(fā)生了急劇的變化。深感政治危機(jī)的佐佐木高行與元田永孚、吉井友實(shí)、土方久元、米田虎雄等侍補(bǔ)于“紀(jì)尾井坂之變”2日后的5月16日諫奏天皇立行親政，受到明治天皇的贊許。他們向伊藤博文等政府要人提出宮府一體以強(qiáng)化天皇的政治權(quán)能和確立侍補(bǔ)的政治職能，具體而言就是天皇御臨閣議，屆時(shí)侍補(bǔ)列席旁聽閣議內(nèi)容并把握已包含的內(nèi)容。

明治11年（1878年）5月18日，天皇參加閣僚會(huì)議，侍補(bǔ)們臨席旁聽迫在眉睫，繼大久保之后任內(nèi)務(wù)卿的伊藤博文和巖倉具視主導(dǎo)的政府反對宮中·府中混淆，堅(jiān)持宮府分離原則，拒絕宮中側(cè)對政府施政的干預(yù)。雖然天皇御臨閣議被認(rèn)可，但干預(yù)政治被抑制，天皇試圖親政受挫深感不滿，伊藤博文和太政大臣三條實(shí)美、右大臣巖倉具視三巨頭政府認(rèn)為年輕的天皇的姿態(tài)輕率、判斷容易變化。佐佐木高行對政府提出抗議但沒有被理睬。天皇掌握人事權(quán)的主張也被否決，天皇希望佐佐木高行就任工部卿一職沒有實(shí)現(xiàn)。

明治11年5月29日，侍補(bǔ)們以“貪污嫌疑”反對井上馨接替伊藤博文的工部卿，兼任侍補(bǔ)的宮內(nèi)卿德大寺實(shí)則與政府策劃侍補(bǔ)解任以抑制侍補(bǔ)們的運(yùn)動(dòng)。同年12月24日，佐佐木高行任海軍省御用掛，吉井友實(shí)任工部省御用掛。他與同為侍補(bǔ)的山口正定海軍中佐致力于明治天皇與海軍之間保持順暢的關(guān)系。當(dāng)時(shí)陸軍試圖創(chuàng)設(shè)直屬于天皇的參謀本部，引起海軍的強(qiáng)烈反彈。憑借天皇深厚的信賴，他們建議陸海軍統(tǒng)帥權(quán)均直屬天皇的提案（參議·海軍卿川村純義的主張）。侍補(bǔ)被允許參與政治意味著侍補(bǔ)與政府試圖妥協(xié)。在此期間，佐佐木高行大力選拔錄用人材，如選派山本權(quán)兵衛(wèi)等留學(xué)英國，引薦伊地知正治、副島種臣入宮內(nèi)省。

但是，侍補(bǔ)集團(tuán)的運(yùn)動(dòng)并沒有停止，明治12年（1879年）3月向政府提交建議書，前年8月至11月，明治天皇巡幸北陸·東海地方時(shí)積極接待地方的民情，回朝后提倡“勤儉”，批判表面化的開化主義并表示緊縮財(cái)政。侍補(bǔ)們急于實(shí)現(xiàn)天皇之意旨，5個(gè)月后的3月10日天皇在咨詢侍補(bǔ)后發(fā)布勤儉之圣旨。侍補(bǔ)們將天皇之意見制成意見書提交政府，內(nèi)容是實(shí)現(xiàn)親政和勤儉、消除政府對元老院越來越多的干涉、天皇之意見應(yīng)反映在政策上。政府出于分裂侍補(bǔ)的目的而發(fā)布人事異動(dòng)令，任命吉井友實(shí)為工部少輔，從宮中轉(zhuǎn)到工部省，以公務(wù)繁忙為由不再履行侍補(bǔ)職，勤儉之理念被抑制并受到政府的籠絡(luò)。但這并不是簡單的分?jǐn)�，政府為了改變侍補(bǔ)的空理空論、讓彼等投入到推進(jìn)開化政策現(xiàn)場，實(shí)地實(shí)踐他們的“勤儉”主張，在現(xiàn)實(shí)中與政府妥協(xié)。工部卿井上馨和海軍卿川村純義受命監(jiān)督引導(dǎo)。此外，天皇的近臣干預(yù)政治的想法引起德大寺實(shí)則的反彈，侍補(bǔ)的辭任、侍補(bǔ)的補(bǔ)充被打亂。

佐佐木高行和元田永孚繼續(xù)推進(jìn)親政運(yùn)動(dòng)，但是元田的“侍補(bǔ)辭任、代之以參議之職責(zé)”的輕率言論使得局勢轉(zhuǎn)向有利于政府一側(cè)。政府抓住時(shí)機(jī)于明治12年（1879年）10月13日廢止侍補(bǔ)制度。這場政爭以侍補(bǔ)派敗北而告終。天皇基于對佐佐木高行、元田永孚、高崎正風(fēng)等人的同情，在侍補(bǔ)廢止之際，給予特許彼等遇事隨時(shí)建言的待遇。

侍補(bǔ)職廢止后，元田留在宮中，佐佐木高行于明治13年（1880年）初被政府派往北日本巡視。同年3月返回東京后就任元老院副議長，吉井友實(shí)亦升遷工部大輔，遠(yuǎn)離宮闕。以廢止侍補(bǔ)換取政府的天皇輔導(dǎo)的約定。明治12年9月井上馨官加參議、明治13年2月田中不二麿就任司法卿都是天皇受制于政府的結(jié)果，輔導(dǎo)之約沒有被遵守，天皇之政治干預(yù)被政府持續(xù)打壓，親政運(yùn)動(dòng)隨著侍補(bǔ)廢止而受挫。

明治13年5月，首席參議兼大藏卿大隈重信主導(dǎo)的“大隈財(cái)政”引發(fā)紛亂，佐佐木高行等人再次加入政爭。大隈重信試圖以募集外債來填補(bǔ)財(cái)政的財(cái)政政策，政府內(nèi)分裂為贊成派和反對派，佐佐木高行、元田永孚、土方久元等原侍補(bǔ)與反對派陣營結(jié)盟并上奏天皇，政府中的反對意見被整合起來奏請?zhí)旎释Ｖ瓜蛲鈬�舉債。以此問題為契機(jī)，原侍補(bǔ)集團(tuán)挾政府的人事和財(cái)政問題為口實(shí)再次集結(jié)，雖然提議沒有實(shí)現(xiàn)，但天皇的信任往往取決于相關(guān)的咨詢之中（谷干城和內(nèi)海忠勝出處進(jìn)退、西園寺公望之拜謁問題之協(xié)商）。

明治14年（1881年），大隈重信提出激進(jìn)的制定憲法·開設(shè)國會(huì)論引起伊藤博文的反彈，同年7月，開拓使官有物出售事件導(dǎo)致世論的激化，佐佐木高行認(rèn)為這是動(dòng)搖政府的好時(shí)機(jī)。因此，以宮中和元老院為舞臺的元田永孚和谷干城共同主導(dǎo)“天皇親政運(yùn)動(dòng)”，以反對出售、驅(qū)逐大隈、強(qiáng)化元老院職權(quán)和廢止參議為訴求。他們掀起擁戴天皇再度親政，排除伊藤等政府要人的派系活動(dòng)被稱為“中正黨”。同年9月結(jié)成的中正黨，其陣容由原侍補(bǔ)集團(tuán)和谷干城、鳥尾小彌太、三浦梧樓、曾我祐準(zhǔn)四將軍為首的非主流派軍人、河田景與、中村弘毅等元老院議官、三好退藏為首的少壯派官僚構(gòu)成。

但是，明治14年10月政府主導(dǎo)“明治十四年政變”，大隈被追放，出售被中止，政府出臺《開設(shè)國會(huì)之詔》（國會(huì)開設(shè)の敕諭）以應(yīng)對中正黨的分裂活動(dòng)，政府的方針是延續(xù)參議兼任各省省卿的體制。10月21日在政變后的人事異動(dòng)中，佐佐木高行就任參議兼工部卿，廢止參議自始至終在政治改革中沒有被采納，天皇親政運(yùn)動(dòng)銷聲匿跡，佐佐木高行入主工部省開始推行新的政策。

工部省的職能是推進(jìn)“殖產(chǎn)興業(yè)”，自明治3年成立以來就一直是長州藩士的據(jù)點(diǎn)。工部卿一職在長州閥的政治家中間交替，土佐閥出身的佐佐木高行的任用屬于特例。這里面同樣有著像吉井一樣達(dá)到矯正勤儉思維的政府之意圖。明治12年吉井由工部少輔升遷為大輔，明治14年內(nèi)定轉(zhuǎn)任日本鐵道社長。佐佐木就任后，長州閥的芳川顯正任工部少輔，芳川的職責(zé)是擔(dān)當(dāng)輔佐并抑制佐佐木在試行勤儉和西歐化開發(fā)事業(yè)之間的折衷妥協(xié)中出現(xiàn)的錯(cuò)誤。

對于推進(jìn)大隈重信于明治13年制定的工廠、礦山等官營事業(yè)出售計(jì)劃（也就是今天的“私有化”），明治15年（1882年）12月和明治16年（1883年）夏季，向政府提交工部省的既定方針的意見書。內(nèi)容是“官營的規(guī)則將束縛商業(yè)流通，官僚擔(dān)當(dāng)將會(huì)減少利潤”，“事業(yè)的整理·統(tǒng)合不需要移交各省，工部省應(yīng)專注于道路、港灣等土木事業(yè)（基礎(chǔ)設(shè)施建設(shè)）”。這是勤儉為適應(yīng)現(xiàn)實(shí)所作的實(shí)踐，雖然認(rèn)同產(chǎn)業(yè)政策的意義，但也批判了官營的低效率和官商勾結(jié)，得出了大規(guī)模的土木事業(yè)應(yīng)由國家運(yùn)營的結(jié)論。

雖然建議沒有被政府采納，佐佐木高行仍積極參與工部省的改革進(jìn)程、組織改造和工廠、礦山出售。雖然閣議不愿意放棄事業(yè)，但在佐佐木極力推動(dòng)和財(cái)政困難的壓力下不得不批準(zhǔn)，深川水泥制造所、品川硝子制造所、中小坂礦山、長崎造船所、阿仁礦山等眾多官營模范工廠向民間出售。此外，在觀察了一段時(shí)間后，明治17年（1884年）3月和10月再度提交工部省的改革案，由于閣議不能作出結(jié)論而陷入停滯。

另一方面，明治15年7月以芳川顯正調(diào)離為契機(jī)，佐佐木高行擺脫掣肘，掌握了工部省的實(shí)權(quán)，任命井上勝為工部大輔。同年8月書記局長林董出使俄羅斯，留守的安川繁成主持事務(wù)，這都是有利的動(dòng)向。佐佐木與安川搭檔調(diào)整制成改革案，在鐵道敷設(shè)上全力支援井上。明治15年2月中山道通車區(qū)間（長濱驛—大垣驛間、東京驛—高崎驛間）的建設(shè)呈報(bào)書采用了井上的提案。明治16年，他一方面與井上討論鐵道工程的繼續(xù)和中山道路線敷設(shè)，另一方面極力阻止設(shè)立私營鐵路，批準(zhǔn)井上的敷設(shè)日本鐵道東北本線的要求。

明治18年（1885年）5月的閣議決定工部省廢止，同年12月，隨著伊藤博文創(chuàng)立內(nèi)閣制度，其業(yè)務(wù)職能被分散，以電信和郵政一體化設(shè)立遞信省，鐵道直屬于內(nèi)閣，工部省完全解體。這是卷入大藏省和內(nèi)務(wù)省之間勢力范圍的爭奪而敗北，工部省的土木事業(yè)部門謀求脫胎換骨被大藏省和內(nèi)務(wù)省拒絕的主要原因。在此情況下，佐佐木高行隨著工部省被廢止和內(nèi)閣制度的實(shí)行被排除在閣外，其政界的影響力逐漸消退，重心向?qū)m中轉(zhuǎn)移。

明治17年（1884年）7月7日，日本頒布華族令，實(shí)行華族制度，佐佐木高行以維新以來之功勛而被特旨敘爵伯爵，列入華族。明治18年（1885年）12月22日任宮中顧問官。明治20年（1887年）5月23日任日本赤十字社監(jiān)督。明治20年（1887年）7月26日任明宮（大正天皇）教育局主任，明治21年（1888年）4月5日任明宮·常宮·周宮養(yǎng)育系主任，擔(dān)負(fù)天皇子女的訓(xùn)育工作。明治21年（1888年）4月30日——明治43年（1910年）3月2日任樞密顧問官。明治23年（1890年）和吉井友實(shí)、千家尊福等人促進(jìn)神祇院復(fù)興運(yùn)動(dòng)沒有被采用，又竭力推動(dòng)西村茂樹等人敬神·尊王·愛國思想的普及。明治29年（1896年）在有關(guān)人士的強(qiáng)烈要求下，就任皇典講究所的第2代所長，竭力重建經(jīng)營狀態(tài)惡化的皇典講究所。雖然在宮中明治天皇的信任一如往昔，但再也沒有干預(yù)政治的機(jī)會(huì)。

明治42年（1909年）4月29日，升敘侯爵，并任帝國議會(huì)·貴族院侯爵議員。明治43年（1910年）3月2日病逝，享年81歲。葬于東京都港區(qū)青山靈園。嫡子佐佐木高美已先逝，爵位由孫子佐佐木行忠承襲，行忠曾任皇典講究所所長、國學(xué)院大學(xué)長、貴族院副議長。

明治元年（1868年）12月12日-敘從五位下。

明治2年（1869年）5月16日-敘從四位下。

明治14年（1881年）7月16日-勛二等。

明治15年（1882年）11月1日-勛一等旭日大綬章。

明治17年（1884年）7月7日-伯爵。

明治17年（1884年）12月27日-敘從三位（特旨進(jìn)升位階）。

明治20年（1887年）4月12日-敘正三位。

明治22年（1889年）11月25日-大日本帝國憲法發(fā)布紀(jì)念章。

明治26年（1893年）6月16日-敘從二位。

明治29年（1896年）3月28日-以明治二十七八年事件之功，賜金杯一組。

明治32年（1899年）1月31日-以七十高齡下賜御紋付御杯并酒肴御料。

明治36年（1903年）6月30日-敘正二位。

明治39年（1906年）1月29日-以高齡老臣特旨賜宮中杖。

明治39年（1906年）4月1日-勛一等旭日桐花大綬章。

明治42年（1909年）2月1日-以八十高齡下賜御紋付御杯并酒肴御料。

明治42年（1909年）4月29日-侯爵。

明治43年（1910年）3月2日-敘從一位（特旨進(jìn)位一級）。

佐佐木高行著有《日本魂：日本精神》、《佐佐木伯爵時(shí)局談》、《佐佐木高行日記：希望之櫻》、《保古飛呂比：佐佐木高行日記》、《勤王秘史：佐佐木老侯昔日談》等。

佐佐木高行與國久市兵衛(wèi)之長女貞子結(jié)婚，婚后育有2男3女。