1974年2月23日，祖峰出生于南京，中學就讀于南京市金陵中學。

1991年，祖峰進入南京汽車制造廠工作。

1996年，考進北京電影學院表演系，并擔任團支書一職。

2000年，畢業(yè)后留校任教直到2006年，期間馬蘇、姚笛曾成為他的學生。

2006年研讀北京電影學院首屆（06級）MFA表演專業(yè)研究生。

1997年，祖峰在北京人藝的小劇場中，演出過話劇《四季愛情》；同年參演個人首部電視劇《潘漢年》。

1999年，祖峰在《魯鎮(zhèn)傳說》扮演丁家昌。

2001年，出演電影《十面埋伏》、《落網(wǎng)黑客》，電視劇《高原騎兵連》。

2003年，出演《沉默的證人》。

2005年，出演電視劇《溫暖》和《沙家浜》。

2006年，執(zhí)導電影《和順的夏天》和《掌聲響亮》。

2007年，和北京人藝合作，先后在舞臺上出演了《北京大爺》、《四世同堂》以及《愛情印象》。

2008年，在電影《輪椅上的奇跡》中飾演許烽一角；同年出演《潛伏》中的李涯一角，并獲華鼎獎最佳男配角獎，祖峰在《潛伏》中扮演的特務李涯也成為了經(jīng)典熒屏形象；8月參演電視劇《密戰(zhàn)》，飾國際商業(yè)間諜兼冷酷殺手蝴蝶。

2009年主演《寶貴的秘密》，飾山村青年照相師藍寶貴；7月，參演電視劇《隱形將軍》，飾玩世不恭的富家公子哥兒韓奎，逐漸成長為優(yōu)秀的共產(chǎn)黨地下工作者；9月，參演鄭曉龍執(zhí)導電視劇《金婚風雨情》，飾迂腐癡情的南方知識分子季誠。

2010年，祖峰參演了電影《天上的伙伴》、《建黨偉業(yè)》、《寶貴的秘密》和電視劇《金婚風雨情》、《旗袍》，憑借《寶貴的秘密》入圍首屆澳門電影節(jié)影帝。

2011年，《愛情的印象》在話劇的舞臺上，祖峰一人分飾8個不同的角色。后憑借在電視劇《旗袍》中出色的表演，再次榮獲華鼎獎最佳男配角獎。

2012年，電視劇《獨狼》與先前《潛伏》里深入人心的李涯形象有所不同，祖峰在《獨狼》里獨挑大梁；12月參演電視劇《婚戰(zhàn)》，飾編輯孟三力。

2013年，在電影《黃金時代》扮演羅烽；4月，第三度與孔笙導演合作，參演電視劇《北平無戰(zhàn)事》飾崔中石，獲國劇盛典年度最佳男配角獎；8月參演電視劇《謀圣鬼谷子》，飾姬元伯；9月參演張藝謀執(zhí)導電影《歸來》，飾反派鄧指導。

2014年8月，參演電視劇《刑警隊長》，飾刑警胡德強；9月，客串鄭曉龍執(zhí)導電視劇《羋月傳》，飾屈原；11月，參演電視劇《畢業(yè)歌》，飾中統(tǒng)特務頭子季家鳴。

2015年5月，參演電視劇《雙刺》，出演獨具魅力的暖男特工彭剛。

2016年5月10日，祖峰曝光了一組寫真大片。

2017年5月參演電視劇《歡樂頌2》，飾演奇點一角。

2018年，參演的電影《無問西東》上映。3月2日，參演的電視劇《面具》開播。6月21日，主演并導演電影《六欲天》。

2010年5月，祖峰與中央戲劇學院老師劉天池結婚。

祖峰性格內(nèi)向，話不多。平日喜好練書法、篆刻、抄經(jīng)、聽戲、讀書。他一直喜歡寫信，大學讀書期間每周都會給父母寫家信報平安。祖峰用毛筆寫給妻子的信，精致的小楷，文辭像古體詩一樣優(yōu)美。由于愛寫字、刻章，祖峰自然對硯臺以及章料石頭有著興趣。

2016年6月5日中午，周迅、吳鎮(zhèn)宇、祖峰主演的懸疑律政電影《保持沉默》在北京舉行“開庭”主題發(fā)布會，三人首度同臺，暢聊片中趣事，并宣布電影定檔8月19日。

出生在“六朝古都”南京的祖峰，這個城市厚重歷史底蘊所累積出來的沉穩(wěn)、內(nèi)斂卻在他身上得到了極好的體現(xiàn)。祖峰是一個優(yōu)秀演員，雖然是個“內(nèi)秀”的實力派，但他的身上顯現(xiàn)的卻是作為文人的一種硬氣與執(zhí)著。（中國廣播網(wǎng)評價）

他是個兼?zhèn)渌伎夹耘c創(chuàng)造性的好演員。（李六乙評價）

祖峰的出彩總是默默的，在不張揚的動作、說話語調(diào)中，他通過眼神、身體語言等細微處理營造出來的整體氛圍，總會讓他扮演的人物活靈活現(xiàn)。（騰訊評價）

熒幕上的祖峰從來不是一個個性演員，因為他真真正正在詮釋每一個“角色”，他演的不是自己，而是千萬劇中人！（網(wǎng)易娛樂評價）

在《北平無戰(zhàn)事》播出后，祖峰飾演的“崔中石”收獲業(yè)內(nèi)外一致好評，他賦予這個人物溫潤如玉、波瀾不驚的氣質(zhì)，驚艷的演出獲得觀眾青睞。在微博票選“劇中最喜歡的角色”中，祖峰以超過57%的支持率遙遙領先；“崔中石”被害依舊不改“崔叔”的超高人氣，網(wǎng)友自發(fā)的話題“崔叔別走”討論超過上百萬。（新浪娛樂評）