土屋昌次是金丸筑前守虎義的次子，幼名平八郎，武田信玄的“奧近習(xí)六人眾”之一。所謂六人眾指的是土屋昌次、三枝守友、武藤喜兵衛(wèi)（即真田昌幸）、甘利昌忠、曾根昌世和長(zhǎng)坂源五郎（即長(zhǎng)坂昌國(guó)）。

武田家年輕一代里的猛將，對(duì)野戰(zhàn)和城戰(zhàn)都出眾的才能。

土屋昌次的初陣就是第四次川中島合戰(zhàn)，當(dāng)時(shí)他年僅十七歲。在這場(chǎng)戰(zhàn)役中，他表現(xiàn)異�；钴S，負(fù)責(zé)守衛(wèi)信玄的本陣，毫無(wú)驚慌失措，在上杉軍的猛攻之下，始終不曾后退過(guò)一步，他的武勇連信玄也為之感慨。這場(chǎng)戰(zhàn)役之后，昌次因功被信玄要求繼承武田氏的名族土屋氏并正式改名為土屋昌次。

在三方原合戰(zhàn)中，土屋昌次接受德川氏大將鳥(niǎo)居元忠的一騎討，并且擊敗了鳥(niǎo)居元忠，因此而得到了雙方的贊揚(yáng)。

土屋昌次是信玄近侍出身，對(duì)信玄十分忠誠(chéng)。在信玄病死之后，曾意欲殉死追隨信玄公而去，但是為弾正忠正高坂昌信所勸。

長(zhǎng)篠合戰(zhàn)中，土屋昌次和穴山信君、馬場(chǎng)信房、真田信綱、真田昌輝、一條信龍率領(lǐng)三千騎兵的武田軍右翼隊(duì)。面對(duì)織田信長(zhǎng)的三千支鐵炮，昌次所在的部隊(duì)雖然突破了第二道防馬柵，但還是被鐵炮擋在了最后一道防馬柵之后。5月21日下午1時(shí)，昌次在隨山縣昌景一起突破馬防柵沖鋒攻擊時(shí)，兩人均遭鐵炮擊中身亡，昌次時(shí)年僅三十二歲。